摘要  目的：建立高效液相色譜法測定復(fù)方益母口服液中鹽酸水蘇堿含量，并與薄層掃描法比較。方法：以Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm)為色譜柱，乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氫鉀溶液（18:82，pH 5.5）為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min^-1，柱溫35℃，檢測波長215 nm，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果：鹽酸水蘇堿含量在1.05 ~ 26.25 µg具有良好的線性關(guān)系，r=0.9997，樣品平均加樣回收率為98.3% (n=9)，RSD為1.17%，重復(fù)性試驗(yàn)RSD為 1.72% (n=5)，精密度試驗(yàn)RSD為 1.23% (n=5)。結(jié)論：本方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可替代薄層掃描法作為控制該制劑質(zhì)量的主要方法。

關(guān)鍵詞  復(fù)方益母口服液，鹽酸水蘇堿，高效液相色譜法

Abstract  Objective: to establish a HPLC method for the determination of stachydrine hydrochloride in Complex Yimu Oral Solution, and compare the results by HPLC and TLCS. Methods: Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm) was used, and CH₃CN- 0.05 mol·L^-1 KDP (18:82, pH 5.5) was used as the mobile phase, with the flow-rate at 1.0 mL·min^-1. Oven temperature was 35℃, and the detective wavelength was 215 nm. Results: stachydrine was well separated from the other impurities, with the standard curve linear range of 1.05 ~ 26.25 µg, r=0.9997. The average recovery of stachydrine was 98.3% (n=9), RSD=1.17%. The results of reproducibility was good, with RSD=1.72% (n=5). The accuracy experiment was also good, with RSD=1.23% (n=5). Conclusion: the HPLC method is much more simple, convenient, reliable and sensitive than TLCS method, and could be used as the main quality-control method for the Complex Yimu Oral Solution.

Key words  Complex Yimu Oral Solution, Stachydrine Hydrochloride, HPLC

作為一種傳統(tǒng)的婦科良藥，益母草性味辛、苦，微寒，具有活血化淤、調(diào)經(jīng)利水之功效，常用于婦女月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、難產(chǎn)，以及跌打損傷、水腫和瘡瘍腫毒等癥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，益母草中益母草堿、水蘇堿等多種活性生物堿也具有改善心肌缺血、增加冠狀動(dòng)脈血流、提高心功能，抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓形成等多種作用，且作用持久^[1]。

復(fù)方益母口服液是由益母丸（中國藥典1977年版）劑型改進(jìn)而成，其中主要有效成分鹽酸水蘇堿是益母草中生物堿類含量測定的指標(biāo)性成分，2005版藥典采用薄層掃描法對其進(jìn)行測定，不僅操作過程繁瑣、所需時(shí)間長，而且水蘇堿在濕度大時(shí)穩(wěn)定性差^[2-5]。本文將高效液相色譜法與薄層掃描法測定復(fù)方益母口服液中主要有效成分鹽酸水蘇堿含量結(jié)果進(jìn)行了比較，表明高效液相色譜法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可作為控制該制劑質(zhì)量的主要方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilengt 1200 系列高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent Co. Ltd.，USA），G1376A高效液相泵，G1367B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1365B多波長UV檢測器，Hystar色譜工作站。薄層色譜掃描儀（CAMAG，SWI）；硅膠GF₂₅₄預(yù)制薄層板（青島海洋化工廠）；復(fù)方益母口服液（山東省臨沂銀雀山制藥廠，10 mL·支^-1，批號2008211，2008423，2008512）；鹽酸水蘇堿對照品（中國藥品生物制品檢定所提供）；乙腈（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純（山東禹王化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 高效液相色譜法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm，天津琛航科技儀器有限公司)；流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氫鉀溶液（18:82，pH 5.5），流速1.0 mL·min^-1，檢測波長215nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 µL。

按照以上色譜條件，取對照品溶液、供試品溶液和不含益母草的陰性對照溶液各10 µL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，鹽酸水蘇堿的保留時(shí)間為6.237 min，色譜柱的理論塔板數(shù)為6800；鹽酸水蘇堿與相鄰峰的分離度 >1.5，符合中國藥典的規(guī)定。陰性對照圖譜在鹽酸水蘇堿色譜峰的保留時(shí)間無干擾色譜峰（圖1）。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的鹽酸水蘇堿對照品適量，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.5 mg·mL^-1的對照品溶液^[6]，搖勻，備用。

1.2.3 供試品溶液的制備

各批號復(fù)方益母口服液以0.45 µm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，分別精密量取續(xù)濾液2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加入甲醇制成供試品溶液，進(jìn)樣10 µL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

取對照品溶液，分別進(jìn)樣2.0、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 µL，記錄色譜峰面積。以峰面積對進(jìn)樣量作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果鹽酸水蘇堿回歸方程：Y = 978.2 X + 21.4，r=0.9997，線性范圍：1.05 ~ 26.25 µg。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液（批號2008423），分別于0、2、4、8、12和24 h測定鹽酸水蘇堿含量，RSD 為0.23%，說明供試品溶液在本實(shí)驗(yàn)條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.6 精密度試驗(yàn)

取1份對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定其峰面積，RSD為1.23%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品溶液（批號2008423）5份，按照1.2.3項(xiàng)下進(jìn)行處理后，分別進(jìn)樣測定鹽酸水蘇堿峰含量，RSD為1.72%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

1.2.8 回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的復(fù)方益母草口服液（批號2008423）適量，按80%、100%和120%的比例，精密加入鹽酸水蘇堿對照品溶液適量，搖勻，進(jìn)樣測定，計(jì)算得平均回收率為98.3%，RSD=1.17% (n=9)。

1.2.9 樣品含量測定

取同一批號樣品（批號：2008423），依法制成供試品液，分別精密量取對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算鹽酸水蘇堿含量，見表1。

1.3 薄層掃描法

1.3.1 線性關(guān)系的考察

吸取1.2.2項(xiàng)下對照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 µL點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，展開后掃描，展開劑為正丁醇-鹽酸-水（8:2:1），顯色劑為稀碘化鉍鉀試液，掃描波長215nm。以鹽酸水蘇堿點(diǎn)樣量（µg）為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的熒光點(diǎn)面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：Y = 2531.1 X + 1864.3，r=0.9831，線性范圍：1.05 ~ 10. 51 µg。

1.3.2 樣品含量測定

分別吸取各供試品液10 µL，對照品液 10 µL，點(diǎn)于同一薄層板上，展開，掃描，測量供試品與對照品吸收度積分值，測定，采用回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見表1。

圖2 對照品和供試品溶液薄層掃描圖

1，2，4，5：供試品；3，6：鹽酸水蘇堿對照品

2 討論

2.1 由表1可以看出，對于同一批號樣品的含量測定結(jié)果，高效液相法較薄層掃描法更穩(wěn)定。因?yàn)辂}酸水蘇堿濕度大時(shí)不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解，且不同批次薄層板的質(zhì)量差異、顯色條件等諸多因素影響，導(dǎo)致薄層掃描法對于鹽酸水蘇堿的定量會有一定的偏差，所以采用高效液相色譜法更為準(zhǔn)確。

2.2 曾對薄層展開條件進(jìn)行了優(yōu)化，最后選定展開劑為正丁醇-鹽酸-水（8:2:1）可以得到較為滿意的分離度。本文還對HPLC的流動(dòng)相進(jìn)行了溶劑系統(tǒng)組成和比例等優(yōu)化，結(jié)果采用乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氫鉀溶液（18:83，pH 5.5），分離效果好，保留時(shí)間適當(dāng)。

2.3 利用高效液相色譜法對復(fù)方益母口服液中的主要成分鹽酸水蘇堿進(jìn)行含量測定，操作簡便，回收率高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，可以作為該制劑質(zhì)量控制的新方法。

圖1 典型HPLC色譜圖

A：對照品溶液  B：陰性對照溶液  C：供試品溶液

表1 樣品測定結(jié)果( mg·mL^-1)

參考文獻(xiàn)：

1．劉新華，辛宏，朱依諄。不僅是“益母”草：益母草的心臟保護(hù)作用， 生理學(xué)報(bào)，2007，59(5): 578-584。

2．益母口服液-含量測定項(xiàng)：紫外分光光度法，中國藥典2005版，P576。

3．唐盈，王曉強(qiáng)。四種含益母草中成藥中水蘇堿的含量測定，藥物分析雜志，1989，9(1): 22-24。

4．張玲，時(shí)延增，于宗淵等。雙波長薄層掃描法測定益母口服液中水蘇堿的含量，中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，27(1): 16-18。

5．姜舜堯，黃曉強(qiáng)，陸蘊(yùn)如。幾種中藥生物堿的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析，現(xiàn)代藥物分析論壇（香港），世界醫(yī)藥出版社，1999，P28。