關(guān)鍵詞  水蘇堿，復(fù)方益母口服液，高效液相色譜法

Abstract  Objective: to establish a HPLC method for the determination of stachydrine in Complex Yimu Koufuye. Methods: Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm) was used as the solid phase, and CH₃CN- 0.05 mol·L^-1 KDP (18:82, pH 5.5) was used as the mobile phase, with the flow-rate at 1.0 mL·min^-1. Oven temperature was 35℃, and the detective wavelength was 215 nm. Results: stachydrine was well separated from the other impurities, with the standard curve linear range of 1.05 ~ 26.25 µg, r=0.9997. The average recovery of stachydrine was 98.1% (n=9), RSD=1.17%. The repeat experiment was good, with RSD=1.72% (n=5). The accuracy experiment was also good, with RSD=1.23% (n=5). Conclusion: the method is simple, convenient, reliable and sensitive, which could be used as the main quality-control method for the Complex Yimu Koufuye.

Key words  Stachydrine, Complex Yimu Koufuye, HPLC

作為一種傳統(tǒng)的婦科良藥，益母草性味辛、苦，微寒，具有活血化淤、調(diào)經(jīng)利水之功效，常用于婦女月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、難產(chǎn)，以及跌打損傷、水腫和瘡瘍腫毒等癥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，益母草中益母草堿、水蘇堿等多種活性生物堿也具有改善心肌缺血、增加冠狀動脈血流、提高心功能，抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓形成等多種作用，且作用持久^[1]。

復(fù)方益母口服液是由益母丸（中國藥典1977年版）劑型改進(jìn)而成，其中主要有效成分水蘇堿是益母草中生物堿類含量測定的指標(biāo)性成分，多采用紫外分光光度法、薄層掃描法和高效毛細(xì)管電泳法進(jìn)行測定，不僅操作過程繁瑣、所需時間長，而且水蘇堿在濕度大時的穩(wěn)定性不夠理想^[2-5]。本文首次應(yīng)用高效液相色譜法測定復(fù)方益母口服液中主要有效成分水蘇堿的含量，方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可作為控制該制劑質(zhì)量的主要方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilengt 1200 系列高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent Co. Ltd.，USA）：G1376A高效液相泵，G1367B自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1365B多波長UV檢測器，Hystar色譜工作站。

1.2 試藥

水蘇堿對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，110712-200508）；復(fù)方益母口服液（山東省臨沂銀雀山制藥廠，10 mL·支^-1，2008211，2008423，2008512）；乙腈（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純（山東禹王化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm，天津琛航科技儀器有限公司提供)；流動相為乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氫鉀溶液（18:82，pH 5.5），流速1.0 mL·min^-1，檢測波長215nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 µL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的水蘇堿適量，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.5 mg·mL^-1的對照品溶液^[6]，搖勻，備用。

2.3 最大吸收波長的選擇

采用島津UV-160紫外分光光度計，對甲醇配制的0.5 mg·mL^-1的對照品溶液在200~400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，于215 nm處有一個最大吸收特征峰，故選擇為檢測波長。

2.4 陰性對照溶液的制備

取不含益母草的陰性對照品，按生產(chǎn)廠家提供的生產(chǎn)工藝以及供試品溶液配制方法制備。

2.5 供試品溶液的制備與測定

各批號復(fù)方益母口服液以0.45 µm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，分別精密量取續(xù)濾液2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加入甲醇制成供試品溶液，進(jìn)樣10 µL。同時取對照品溶液10 µL進(jìn)樣，分別測定吸收峰面積，按外標(biāo)法計算樣品的含量。結(jié)果見表3。

2.6 系統(tǒng)適用性試驗

理論塔板數(shù)：按照以上色譜條件，進(jìn)樣水蘇堿對照品溶液10 µL，記錄色譜圖，水蘇堿的保留時間為6.237 min，測得色譜柱的理論塔板數(shù)為6800。

分離度：取供試品溶液、陰性對照液，分別進(jìn)樣，水蘇堿的保留時間為6.075 min，根據(jù)相鄰最近峰的保留時間計算水蘇堿的分離度 >1.5，符合中國藥典的規(guī)定。陰性對照圖譜在水蘇堿色譜峰的保留時間無明顯吸收峰（圖1），表明處方中其他成分對水蘇堿的測定無干擾。

圖1 典型HPLC色譜圖

A：對照品溶液  B：陰性對照溶液  C：供試品溶液

Figure 1 typical HPLC chromatographs

A: Standard Solution B: Negative Control Solution C: Sample Solution

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

取對照品溶液，分別進(jìn)樣2.0、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 µL，記錄其色譜峰的峰面積。以峰面積對進(jìn)樣量作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果水蘇堿回歸方程：Y = 978.2 X + 21.4，r=0.9997，線性范圍：1.05 ~ 26.25 µg。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品溶液（批號2008423），分別于0、2、4、8、12和24 h測定水蘇堿含量，RSD為0.23%，說明供試品溶液在本實驗條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 精密度試驗

取1份對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定其峰面積。結(jié)果表明，實驗精密度良好，RSD為1.23%。

2.10 重復(fù)性試驗

取同一批供試品溶液（批號2008423），重復(fù)進(jìn)樣5次，測定水蘇堿峰含量，結(jié)果表明，實驗重復(fù)性良好，RSD為1.72%。

2.11 回收率試驗

依2.5法，精密量取已知含量的復(fù)方益母草口服液（批號2008423）適量，按80%、100%和120%的比例，精密加入水蘇堿對照品溶液適量，搖勻，進(jìn)樣測定，計算得平均回收率為98.1%，RSD=1.17% (n=9)。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

Table 1 the results of the recovery experiments

2.12 樣品測定

分別精密量取對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以峰面積分別計算得3批口服液樣品水蘇堿的含量為0.71mg·mL^-1，RSD為2.23%。

3 討論

3.1 復(fù)方益母口服液中含水蘇堿、益母草堿、益母草定和益母草寧等多種生物堿，其中水蘇堿為主要的活性成分，具有擴(kuò)張外周血管、增加血流量、抗血小板凝集等作用，選擇測定制劑中水蘇堿具有代表性。

3.2 本文對HPLC的流動相進(jìn)行過溶劑系統(tǒng)組成和比例等優(yōu)化研究。生物堿類成分使用C18反相柱進(jìn)行分析時，由于反相柱的封尾不完全，殘存的微酸性硅醇基團(tuán)會與生物堿類成分發(fā)生化學(xué)吸附而導(dǎo)致拖尾現(xiàn)象，而流動相中微量的酸能使生物堿類成分預(yù)先達(dá)到“酸飽合”的效果，減少了生物堿類成分與反相柱硅醇基的吸附，改善拖尾。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，本文所采用的乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氫鉀溶液（18:83，pH 5.5），分離效果好，保留時間適當(dāng)。

3.3 利用高效液相色譜法對復(fù)方益母口服液中的主要成分水蘇堿進(jìn)行含量測定，回收率高，操作簡單，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，可以作為該制劑質(zhì)量控制的新方法。

參考文獻(xiàn)：

1．劉新華，辛宏，朱依諄。不僅是“益母”草：益母草的心臟保護(hù)作用，生理學(xué)報，2007，59(5): 578-584。

2．益母口服液-含量測定項：紫外分光光度法，中國藥典2005版，P576。

3．唐盈，王曉強(qiáng)。四種含益母草中成藥中水蘇堿的含量測定，藥物分析雜志，1989，9(1): 22-24。

4．張玲，時延增，于宗淵等。雙波長薄層掃描法測定益母口服液中水蘇堿的含量，中國藥科大學(xué)學(xué)報，1996，27(1): 16-18。