[摘要] 目的：建立硼酸沖洗劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。 方法：根據(jù)《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄收載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，采用鱟試劑法對(duì)硼酸沖洗劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 結(jié)果：經(jīng)2倍稀釋并調(diào)節(jié)pH到6的硼酸沖洗劑對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無(wú)干擾作用，可用靈敏度為0.25EU的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。 結(jié)論：鱟試劑法可用于硼酸沖洗劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 硼酸沖洗劑 細(xì)菌內(nèi)毒素 鱟試劑 干擾試驗(yàn)

[Abstract] Objetive: To establish an inspection method for bacterial endotoxin in boric acid rinse. Methods：According to China Pharmacopoeia 2005, the tachypleus amebocyte lysate (TAL) method was applied for the investigation of disturbing and bacterial endotoxin test．Results: there is no interference to the reaction of bacterial endotoxin and TAL with the sensitivity of 0.25 EU·mL^-1 when the sample was 2-fold diluted and adjusted the pH to 6． Conclusion: The TAL method can control the limit of bacteria1endotoxins in boric acid rinse.

[Key words] boric acid rinse; Bacterial endotoxin; Tachypleus amebocyte lysate; Interference test

硼酸溶液為我院自制外用制劑，用于皮膚、粘膜及傷口的消毒，濕敷^[1]，以前被批準(zhǔn)為溶液劑管理，2009年在北京市藥監(jiān)局下發(fā)的醫(yī)院制劑批準(zhǔn)文件中，將其納入沖洗劑管理。依據(jù)《中國(guó)藥典》2005年版（二部）的規(guī)定，沖洗劑應(yīng)增加細(xì)菌內(nèi)毒素或熱原的檢查^[2]。但是原來(lái)作為溶液劑管理的硼酸制劑沒(méi)有關(guān)于鱟試劑法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的報(bào)道，本文參照藥典中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求^[2]，對(duì)我院生產(chǎn)的硼酸沖洗劑進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究。

1 儀器與試藥

CS101-E電熱鼓風(fēng)干燥箱(重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，儀表恒溫水浴鍋(黃驊市綜合電器廠)，MSI Minishaker漩渦混勻器(廣州IKA公司)。

硼酸原料藥（純度：≥99.5%，批號(hào)：080213，北京燕京藥業(yè)）；硼酸沖洗劑（3%，200ml，批號(hào)：20090318、20090320、20090331，北京世紀(jì)壇醫(yī)院）；供干擾預(yù)試驗(yàn)及干擾試驗(yàn)用硼酸沖洗劑（3%，200ml，批號(hào)：20090311、20090312、20090313、20090316、20090317、20090323，自制）；5%碳酸氫鈉注射液（批號(hào)：07122441，天津藥業(yè)焦作有限公司）；鱟試劑（TAL，0.l ml/支，靈敏度：0.25，0.125 EU·ml^-1，批號(hào)：0810230，0709050，湛江博康海洋生物有限公司；靈敏度：0.25 EU·ml^-1，0.125 EU·ml^-1，批號(hào)：0802201，0903131，湛江安度斯生物有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（規(guī)格：120EU/支，批號(hào)：150601-200862，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；內(nèi)毒素檢查用水（BET水，規(guī)格：2 ml/支，批號(hào)：080905，湛江博康海洋生物有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)

按《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，對(duì)不同廠家的標(biāo)示靈敏度分別為0.25及0.125 EU·mL^-1的TAL進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn)，另取2管復(fù)溶好的0.1ml鱟試劑安瓿，向其中加入0.1ml 的BET水作為陰性對(duì)照（NS）結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果

Tab 1 Sensitivity rechecking result of TAL

表1中，λc根據(jù)公式λ_c=lg^-1（∑X/4）計(jì)算，結(jié)果均在0.5λ～2λ之間，結(jié)果均符合規(guī)定，故4個(gè)批號(hào)的鱟試劑均可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.2 硼酸沖洗劑細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版（二部）附錄IS中規(guī)定，沖洗劑的L值應(yīng)小于0.5 EU·mL^{-1 [2]}。

2.3 硼酸沖洗劑最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的確定

市售鱟試劑規(guī)格為0.03~0.50 EU·mL^-1，按照公式MVD＝C L/λ計(jì)算，其中，L為藥典規(guī)定的最大限值0.5 EU·mL^-1，當(dāng)L以EU·mL^-1表示時(shí)，C為1.0ml·mL^-1，λ為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，代入上式計(jì)算。若使用標(biāo)示靈敏度為0.06 EU·mL^-1的鱟試劑檢測(cè)時(shí)，MVD_0.06＝8.33（倍），同理，MVD_0.125＝4，MVD_0.25＝2，MVD_0.5＝1。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)

稱取處方量的硼酸原料藥，選用市售除熱原的滅菌注射用水為溶媒，在層流超凈工作臺(tái)環(huán)境下制備硼酸溶液，制備最終稀釋倍數(shù)為1、2、4、8的溶液，用5%的碳酸氫鈉注射液分別調(diào)節(jié)各稀釋后溶液的pH至6。將此系列濃度溶液作為供試品溶液（NPC），同時(shí)在上述系列溶液中加入含有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為供試品陽(yáng)性液（PPC）。取靈敏度（λ）為0.25 EU·mL^-1的不同廠家的鱟試劑與上述PPC和NPC進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)濃度平行做2支，同時(shí)作陽(yáng)性（PC）和陰性對(duì)照（NC），鱟試劑對(duì)不同濃度的樣品的測(cè)試比較，見(jiàn)表2。

表2 干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

Tab 2 result of preliminary interference test

表2的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，調(diào)節(jié)pH后的硼酸沖洗劑在稀釋2倍及以上時(shí)對(duì)兩種鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無(wú)干擾作用。

2.5 干擾試驗(yàn)

為了進(jìn)一步確認(rèn)是否存在干擾，進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。制備硼酸溶液，制法同干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)，用內(nèi)毒素檢查用水將其稀釋2倍并用5%的碳酸氫鈉注射液調(diào)節(jié)pH至6，將此溶液作為干擾試驗(yàn)的供試品。以該樣品為溶媒，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成濃度為2λ、1λ、0.5λ和0.25λ的溶液。同時(shí)分別以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和供試品溶液作陰性對(duì)照。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和Et）。Es＝lg^-1（∑Xs/4）；Et＝lg^-1（∑Xt/4），其中，Xs和Xt分別為BET水和供試品溶液為溶媒組的各反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 干擾試驗(yàn)結(jié)果

Tab 3 result of interference test

結(jié)果表明，三批測(cè)得的Et/Es均在0.5～2之間，可證明硼酸沖洗劑在稀釋2倍并調(diào)節(jié)pH至6時(shí)對(duì)鱟試劑無(wú)干擾作用，可用鱟試劑法對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)。

2.6 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法驗(yàn)證

取我院生產(chǎn)的硼酸沖洗劑三批，用滅菌注射用水稀釋2倍并用5%的碳酸氫鈉注射液調(diào)節(jié)pH至6，將稀釋后的溶液依照《中華人民共和國(guó)藥典》2005版“細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法”檢查。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

Tab 4 result of Bacterial endotoxin test

三批結(jié)果均符合藥典的規(guī)定。

3 討論

供干擾預(yù)試驗(yàn)及正式干擾試驗(yàn)用硼酸沖洗劑的配制過(guò)程中，必須排除溶媒可能引入的細(xì)菌內(nèi)毒素，故選用除熱原的滅菌注射用水為溶媒配制，試驗(yàn)前需將玻璃儀器于250℃下干熱滅菌1小時(shí)去除內(nèi)毒素。保證干擾試驗(yàn)結(jié)果為硼酸原料對(duì)鱟試劑檢測(cè)方法的的干擾結(jié)果。

硼酸沖洗劑原液的PH為4.3，稀釋2倍后的PH為5.0，均不在藥典鱟試劑法測(cè)定內(nèi)毒素中規(guī)定的6～8的范圍。曾使用未調(diào)節(jié)pH的硼酸沖洗劑原液和稀釋2倍后的溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)操作，結(jié)果使用上述兩種溶液的所有濃度組的所有平行管都未出現(xiàn)膠凝現(xiàn)象，即都顯示為陰性結(jié)果，可判定上述兩種溶液對(duì)鱟試劑皆有干擾。故考慮使用碳酸氫鈉注射液中和硼酸溶液，將PH調(diào)節(jié)到6～8的范圍。但在實(shí)際試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，若調(diào)節(jié)后的pH超過(guò)6.5，則干擾試驗(yàn)也會(huì)出現(xiàn)全陰性結(jié)果，即也存在干擾，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)觀察、論證，發(fā)現(xiàn)將pH調(diào)到恰好超過(guò)6時(shí)，干擾試驗(yàn)的結(jié)果顯示無(wú)干擾。相對(duì)于每100 ml稀釋后的硼酸沖洗劑，pH調(diào)節(jié)劑的用量約為0.2 ml，不會(huì)影響到樣品稀釋的倍數(shù)，且重復(fù)性好，符合藥典的規(guī)定。

參考文獻(xiàn)：

[1] 邵丹，廖銀根，葉發(fā)舜. 硼酸濕敷藥巾的制備及質(zhì)量控制[J]. 中國(guó)藥房，2006，17（3）:191.